WiDr人大腸癌細(xì)胞

測(cè)定方法.

一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)

根據(jù)凋亡細(xì)胞固有的形態(tài)特征,人們已經(jīng)設(shè)計(jì)了許多不同的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法.

1、光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡

（1） 未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,細(xì)胞凋亡晚期可見(jiàn)凋亡小體.貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落.

（2） 染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等.凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化,核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài).

2、熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

 一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來(lái)評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況.

常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI.三種染料與 DNA的結(jié)合是非嵌入式的,主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū).紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光.

Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料,儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,使用時(shí)用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml.DAPI為半通透性,用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色.儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml. 結(jié)果評(píng)判：細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased）,部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；aⅡ期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；bⅡ期的細(xì)胞核裂解為碎塊,產(chǎn)生凋亡小體細(xì)。

WiDr人大腸癌細(xì)胞

 細(xì)胞處理方法：

一、貼壁細(xì)胞
1、 接收到細(xì)胞，肉眼觀察細(xì)胞培養(yǎng)基顏色，顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收到時(shí)的培養(yǎng)瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時(shí)的細(xì)胞 100X,200X 各一張）。
2、用 75%的酒精消毒外包裝,在超凈工作臺(tái)內(nèi)打開(kāi)外包裝。
3、嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作規(guī)范，打開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
4、37度平衡1-2小時(shí)。
5、用移液管吸取培養(yǎng)基，到50ml離心管中，剩下細(xì)胞密度達(dá)到80%至90%可以傳代，如沒(méi)有達(dá)到添加6ml新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
6、如果肉眼檢查上清有細(xì)胞，對(duì)50ml上清進(jìn)行離心收集細(xì)胞，如果細(xì)胞連片狀態(tài)，棄掉上清對(duì)收集的細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化（1ml胰酶37度），接種培養(yǎng)。

二、懸浮細(xì)胞
1、接收到細(xì)胞，肉眼觀察細(xì)胞培養(yǎng)基顏色，顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收到時(shí)的培養(yǎng)瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時(shí)的細(xì)胞 100X,200X 各一張）。
2、用 75%的酒精消毒外包裝,在超凈工作臺(tái)內(nèi)打開(kāi)外包裝。
3、嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作規(guī)范，打開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
4、細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基用吸管*吸出（嚴(yán)禁直接傾倒）。
5、1000rpm，5min 離心，用吸管小心吸出上清，加入培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞。
6、將重懸好的細(xì)胞轉(zhuǎn)入六孔板或者細(xì)胞培養(yǎng)瓶種，加入新鮮培養(yǎng)基，置于 37℃，5%CO2 培養(yǎng)（大部分細(xì)胞）。